teknik biakan murni dan pewarnaan gram

TEKNIK BIAKAN MURNI DAN PEWARNA GRAM

Oleh :

IMFRANTONI PURBA

05111003014

TEKNOLOGI PERTANIAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SRIWIJAYA

2012

A. PENDAHULUAN

Mikroorganisme dapat ditemukan dari lingkungan air, tanah dan udara atau substrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Populasi dari mikroba yang ada dilingkungan ini sangatlah beraneka ragam sehingga dalam mengisolasi diperlukan tahap penanaman agar diperoleh koloni yang tunggal, pemindahan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri memerlukan beberapa ketelitian. Pengerjaan inokulasi benar-benar harus steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi yaitu masuknya mikroba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh didalam medium adalah benar-benar biakan murni (Dwidjoseputro, 2005)

Identifikasi dan determinasi biakan murni bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan meliputi pengamatan sifat morfologi koloni, morfologi sel bakteri bentuk dan ukuran serta sifat hasil pengecetan gram, pengujian sifat-sifat morfologi koloni dan selnya. Perlu dilakukan pengujian patogenesis dan serologinya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh beberapa faktor luar yaitu substrat pertumbuhan atau media, pH, temperatur dan beberapa bahan kimia, maka bakteri yang nampak kemungkinan mempunyai morfologi yang sama, tetapi keperluan nutrisi dan persyaratan ekologinya berbeda (Buckle, 2007).

Teknik pewarnaan gram pertama kali diuraikan dalam suatu publikasi pada tahun 1884 oleh seorang ahli bakteriologi Denmark, Christian Gram.Pada pemeriksaan laboratorium, pewarnaan sangat membantu untuk memperjelas gambaran spesimen yang diperiksa baik morfologi, struktur maupun organel yang dimiliki suatu organisme atau jaringan. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan zat pewarna yang mempunyai kemampuan dalam mewarnai sel organisme dan jaringan sesuai dengan sifat-sifatnya. Secara kimiawi, senyawa yang memberikan warna tersebut disebut chromophore yang bersifat tidak permanent dalam mewarnai sel atau jaringan, yang dimaksud zat pewarna adalah suatu senyawa organik kompleks yang mengandung khromophore (pembawa warna) dan auxochrome (radikal pengikat warna) (Rusdimin, 2003).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Adam, 2000).

B. TUJUAN

             Untuk mengisolasi dan mengidentifikasi mikroorganisme dari suatu sampel.

C. BAHAN DAN ALAT

            Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu: 1) beaker glass, 2) bunsen, 3) jarum ose, 4) kaca preparat, 5) kaca objek, 6) pipet mikro, 7) pipet tetes, spray alkohol, 9) tabung reaksi 10) cawan petri 11) media 12) erlenmeyer 13) lamina flow 14) auto clave 15) inkubator.

            Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu: 1) aquadest, 2) alkohol, 3) larutan crystal violet, 4) larutan mordan iodin, 5) larutan safranin 6) yoghurt.

D. CARA KERJA

            Cara kerja yang harus dilakukan pada praktikum teknik biakan murni dan pewarna gram ini yaitu:

A.    Teknik Biakan Murni
1. Agar dimasak didalam erlemeyer sebanyak 3,64 gr dan ditambah 130 ml aquadest, tunggu sampai agak mendidih.
2. Ketujuh buah tabung reaksi diisi dengan aquadest sebanyak 9 ml.
3. 1 ml dari tabung pertama diambil lalu dipindahkan ke tabung kedua dan seterusnya sampai tabung terakhir atau lebih dikenal dengan pengenceran.
4. Media agar dituang ke dalam cawan secukupnya dan diratakan.
5. Jarum ose dicelupkan kedalam tabung hasil pengenceran paling akhir dan dilakukan teknik penggoresan
6. Cawan ditutup dengan plastik wrap dan dimasukkan ke inkubator.

B.      Pewarnaan gram
1. Alat-alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum terlebih dahulu di persiapkan.
2. Bakteri di dalam media diambil dengan menggunakan jarum ose dan dioleskan pada kaca preparat lalu.
3. bakteri tersebut di tetesi dengan kristal violet sebanyak 2 tetes sebagai pewarna utama 1 menit.
4. Kemudian disiram dengan aquadest.
5. Selanjutnya ditetesi dengan larutan mordan iodin 2 tetes.
6. Disiram lagi dengan aquadest.
7. Tetesi dengan alkohol selama 10 detik.
8. Sama seperti sebelumnya disiram dengan aquadest.
9. Terakhir ditetesi dengan larutan safranin dan di lanjutkan dengan penyiraman aquadest.
10. Perubahan warna diamati dengan menggunakan mikroskop.

E. HASIL DAN PEMBAHASAN

            Hasil dari praktikum ini adalah sebagai berikut :

Tabel

Kelompok	Warna	Bakteri gram (+/-)
1	ungu	+
2	ungu	+
3	ungu	+
4	ungu	+

B.    Pembahasan

            Praktikum teknik biakan murni dan pewarna gram digunakan untuk memisahkan satu jenis bakteri dari biakkan campuran menjadi biakan murni yaitu biakkan yang hanya terdiri dari satu jenis mikrorganisme  dan digunakan pewarnaan gram untuk mengetahui jenis bakteri tersebut gram positif atau negatif. Ada 4 teknik goresan yang dilakukan yaitu goresan t, goresan kuadran, goresan radian dan goresan sinambung. Penggoresan dilakukan untuk membentuk koloni yang terpisah/ tidak membentuk 1 koloni saja.

            Jarum ose dipanaskan hingga membara berfungsi untuk mensterilsasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain, sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolate biakan induk dibuka, kemudian bibir tabung di panaskan berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain. Setelah itu, jarum ose dimasukan pada medium biakan induk, jarum ose bentuk bulat untuk inokulasi bakteri. Mulut tabung reaksi yang berisi isolate biakan induk dipanaskan kembali, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mokroorganisme lain.

            Inokulum disimpan dalam incubator agar medium dapat tumbuh pada wadah yang steril dengan menyeting suhu 37⁰C sebagai suhu opimum bakteri untuk tumbuh, kemudian di amati dan di foto bentuk koloni yang terbentuk setelah di inkubasi selama 2x24 jam, medium yang digunakan adalah larutan nutrient agar. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop.

            Bakteri gram positif berwarna ungu adalah bakteri yang mampu mengikat kuat cat utama violet kristal dan tidak terlunturkan oleh aseton alkohol. Sehingga tidak terpengaruh cat penutup safranin. Bakteri gram negatif berwarna merah adalah bakteri yang dinding selnya tidak mampu menyerap kuat cat utama violet kristal sehingga mudah terlunturkan oleh alkohol dan akhirnya selnya tertutup cat penutup safranin.

Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal.

F. KESIMPULAN

     Kesimpulan pada praktikum kali ini adalah :

1.        Isolasi bakteri artinya memisahkan satu jenis bakteri dari biakkan campuran menjadi biakan murni yaitu biakkan yang hanya terdiri dari satu jenis mikrorganisme.

2.        Jika yang di hasilkan berwarna merah maka bakteri yang tumbuh pada media adalah bakteri gram negatif.

3.        Jika yang di hasilkan berwarna ungu maka bakteri yang tumbuh pada media adalah bakteri gram positif.

4.        Perbedaan pada gram negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu karena dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya.

5.        Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane, crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal.

DAFTAR PUSTAKA

Adam, M. 2000. Mikro Biologi Dasar. Jakarta : Erlangga

Buckle.2007 Mikrobiologi Terapan. Universitas Gajah Mada: Yogyakarta

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan; Jakarta

Rusdimin.2003. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Pt Gramedia